Nascida em Montana, a mãe de Lily Gladstone era uma especialista em educação infantil e seu pai um jornalista de radiodifusão. Ela tem "afiliações tribais, por parte de seu pai, que incluem Kainai, Amskapi Piikani (também conhecida como a Tribo Blackfeet) e as Primeiras Nações Nimi'ipuu". Seu tataravô materno era primo-irmão do primeiro-ministro britânico William Gladstone (de 1868-1894, enquanto do lado de seu pai, seu tataravô era o chefe do tratado, Red Crow. Gladstone foi criada em Browning, Montana, em da Reserva Indígena Blackfeet até os 11 anos, após o qual sua família se mudou para Seattle por motivos econômicos. Ela se formou com grandes honras na Universidade de Montana em 2008 com um BFA em Atuação / Direção e especialização em Estudos Nativos Americanos.
O papel de destaque de Gladstone veio em 2016, em Certain Women, de Kelly Reichardt, onde ela interpretou uma rancheira solitária e não identificada que se apaixona por um professor em uma escola noturna local. Seu desempenho comovente e atencioso lhe rendeu o prêmio Los Angeles Film Critics Association de Melhor Atriz Coadjuvante e o Prêmio da Sociedade de Críticos de Cinema de Boston de Melhor Atriz Coadjuvante, além de indicações para o Independent Spirit Award de Melhor Coadjuvante e o Prêmio Gotham Independent Film de Revelação Ator.
Em 2017, Gladstone juntou-se à companhia de atuação do Oregon Shakespeare Festival e em 2020 ela estrelou a produção de Manhattan de Mary Kathryn Nagle no Yale Repertory Theatre.
Em 2019, Gladstone interpretou a esposa do Chief Factor no drama americano First Cow, também dirigido por Kelly Reichardt. O filme ganhou o prêmio de Melhor Filme no 2020 New York Film Critics Circle Awards e foi eleito um dos dez melhores filmes de 2020 pelo National Board of Review. 2019-2020 ela interpretou Roxanne na série dramática de televisão Billions.
