Nicholas Brendon nasceu três minutos depois de seu irmão gêmeo idêntico, o ator Kelly Donovan, em 12 de abril de 1971 em Los Angeles, Califórnia. Ele frequentou a Chatsworth High School, onde lutou contra a gagueira, mas também foi titular no time de beisebol. Ele sonhava em jogar pelo L.A. Dodgers, mas teve que buscar outras opções quando machucou o braço cerca de um ano depois de se formar no ensino médio.
Ele teve sua grande chance como ator quando conseguiu o papel de Xander Harris na série de TV de enorme sucesso Buffy the Vampire Slayer (1997). A série durou de 1997 até 2003, conquistando um grande culto de seguidores, bem como uma grande base de fãs para Brendon. Brendon e o irmão Kelly apareceram juntos no episódio "The Replacement", no qual Xander tem que lidar com uma dupla aparentemente sinistra. Seu primeiro papel importante em um longa-metragem veio com a sátira de Charles Busch, Psycho Beach Party (2000). Brendon também estrelou o filme original do ABC Family Channel, Celeste in the City (2004). Brendon é um porta-voz da Stuttering Foundation of America, aparecendo em uma campanha impressa para a organização.
