Margaret Colin nasceu no Brooklyn, Nova York e foi criada em Long Island.Ela se formou na Baldwin Senior High School em 1976.Margaret começou a atuar em The Edge of Night (1956) (sua personagem era uma herdeira e ex-terrorista, com sete tentativas de assassinato), e foi contratada em seguida em As the World Turns (1956), interpretando a personagem Margo Montgomery.A primeira aparição de Margaret no cinema foi como professora em Pretty in Pink (1986), de John Hughes, seguida por um papel em Something Wild (1986), de Jonathan Demme, onde interpretou Irene, namorada do personagem de Ray Liotta.No ano seguinte, ela teve papéis coadjuvantes em Like Father Like Son (1987) e Three Men and a Baby (1987).No cinema, Margaret teve papéis secundários ou coadjuvantes;é seu trabalho na televisão que talvez a torne mais memorável.Sra. Colin continuou atuando com papéis em Chicago Hope (1994) e The Wright Verdicts (1995).Em 2000, Margaret ganhou um prêmio Saturn de Melhor Atriz de TV de Gênero por seu papel como Lisa Wiseman na série Now and Again (1999).De 2007 a 2013, ela interpretou Eleanor Waldorf na série Gossip Girl (2007).
