Seth Woodbury MacFarlane nasceu na pequena cidade de Kent, Connecticut, na Nova Inglaterra, onde morava com sua mãe, Ann Perry (Sager), uma funcionária do escritório de admissões, seu pai, Ronald Milton MacFarlane, um professor de escola preparatória, e sua irmã, Rachael MacFarlane, agora dubladora e cantora. Ele tem ascendência inglesa, escocesa e irlandesa e descende de passageiros do Mayflower.
Seth frequentou e estudou animação na Rhode Island School of Design e, após se formar, foi contratado pela Hanna-Barbera Productions (agora chamada Cartoon Network Studios) trabalhando como animador e roteirista na série de TV Johnny Bravo (1997) e Cow e Chicken (1997). Ele também trabalhou para a Walt Disney Animation como escritor da série de TV Jungle Cubs (1996). Ele criou The Life of Larry (1995), que originalmente deveria ser usado como um meio-termo em MADtv (1995). Infelizmente, o negócio não deu certo, mas, alguns meses depois, os executivos da FOX o chamaram em seus escritórios e lhe deram US $ 50.000 para criar um piloto do que viria a se tornar Family Guy (1999).
Desde a estreia de Family Guy, MacFarlane começou a criar dois outros programas de televisão - American Dad! (2005) e The Cleveland Show (2009). MacFarlane começou a se estabelecer como ator, dublador, animador, escritor, produtor, diretor, comediante e cantor ao longo de sua carreira. MacFarlane também escreveu, dirigiu e estrelou Ted (2012) e sua sequência Ted 2 (2015), e A Million Ways to Die in the West (2014). Ele expressou o mouse, Mike, no musical de animação Sing (2016).
