Samuel Henry John Worthington nasceu em 2 de agosto de 1976 em Surrey, Inglaterra. Seus pais, Jeanne (Martyn) e Ronald Worthington, um funcionário da usina, transferiram a família para a Austrália quando ele tinha seis meses de idade e criaram ele e sua irmã Lucinda em Warnbro, um subúrbio de Perth, Austrália Ocidental.
Worthington graduou-se no NIDA (Instituto Nacional de Arte Dramática da Austrália) em 1998, aos 22 anos. Ele recebeu elogios da crítica por sua interpretação de "Arthur Wellesley" em seu primeiro papel profissional na produção do Teatro de Rua Belvoir "Judas Kiss" (dirigido por Neil Armfield). Ele então passou a trabalhar na televisão australiana em séries como Water Rats (1996) e "Backburner" e, em seguida, no 100º episódio do programa de TV americano JAG (1995) (Boomerang: Parte 1).
Worthington fez sua estréia no cinema no altamente aclamado filme australiano Bootmen (2000), um filme sobre uma tropa de "cachorros da torneira". Os papéis secundários seguiram-se em Hart's War (2002) e A Matter of Life (2001) antes de ser escalado para outro drama australiano, Dirty Deeds (2002), co-estrelado por Toni Collette e John Goodman.
No ano seguinte, ele estrelou ainda outro filme australiano, contracenando com David Wenham em Gettin 'Square (2003). O diretor do filme, Jonathan Teplitzky, originalmente testou atores que eram até 8 anos mais velhos do que Worthington, então com 27 anos de idade. Teplitzky não tinha certeza se Sam "poderia convincentemente interpretar um cara durão e também ter elementos do protagonista sobre ele", mas no final Teplitzky decidiu que ele era "fantástico" e tinha "David tocando o cúmplice mais velho e um pouco mais tenso". proclamando "funcionou".
Mas não foi até 2004 que Sam conseguiu sua grande chance. Foi-lhe oferecido o papel principal no aclamado drama australiano Somersault (2004), de Cate Shortland, contracenando com Abbie Cornish. O filme foi vencedor do prêmio Australian Film Institute em 2004, vencendo 13 categorias de filmes - a primeira vez que isso aconteceu na história do prêmio. Worthington também ganhou o prêmio AFI de Melhor Ator Masculino.
A carreira de Worthington decolou internacionalmente quando ele foi escalado como Jake Sully em Avatar de James Cameron (2009) e como Marcus Wright, um ciborgue que ajuda os humanos, apesar de suas suspeitas sobre ele em Terminator Salvation (2009). Worthington logo se tornou um nome familiar, e estrelando em filmes de alto perfil Clash of the Titans (2010), A Dívida (2010), Texas Killing Fields (2011), Homem em um Ledge (2012) e Wrath of the Titans (2012) . Worthington também forneceu a voz para os videogames Call of Duty: Black Ops.
Em 2010, a Worthington iniciou uma produtora, a Full Clip Productions, com dois de seus amigos mais próximos, John Schwarz e Michael Schwarz. A empresa uniu-se aos estúdios da Radical para imprimir duas graphic novels, Damaged and Patriots.
